BREVET 2008 SUPER

United States Patent Application 20090060950
Kind Code A1
Kistner, Otfried, et al. 5 mars 2009
Procédé de fabrication de vaccins viraux

Résumé

La présente invention fournit une méthode pour la fabrication d'une préparation comprenant des antigènes de virus comportant une inoculation) des cellules avec des virus infectieux dans un fluide, b) la propagation de ce virus dans lesdites cellules, c) la collecte a propagé le virus, d) l'inactivation dit collectés virus, et e) de traiter ce virus inactivé avec un détergent, ce qui entraîne une préparation comprenant des antigènes viraux.
Inventeurs: Kistner; Otfried; (Vienne, Autriche); Tauer; Christa; (Vienne, Autriche); Barrett, Noel; (Klosterneuburg / Weidling, AT); Mundt, Wolfgang; (Vienne, AT)
Nom et adresse de correspondance:

BAXTER HEALTHCARE CORPORATION
ONE Baxter Parkway, DF2-2E
DEERFIELD
IL
60015
Etats-Unis

Nom et adresse de cessionnaire: BAXTER INTERNATIONAL INC
Deerfield
IL

Baxter Healthcare
Wallisellen

Numéro de série: 199977
Série Code: 12
Dépôt: 28 août 2008

U. S. classe courante: 424/209.1; 424/204.1
U. S. Class à parution: 424/209.1; 424/204.1
Intern'l Classe: A61K 39/145 20060101 A61K039/145; A61K 39/12 20060101 A61K039/12; A61P 31/16 20060101 A61P031/16
Revendications

1. Une méthode pour la fabrication d'une préparation comprenant les antigènes du virus comprisinga) l'inoculation de cellules avec des virus infectieux dans un fluide, b) la propagation de ce virus dans lesdites cellules, c) la collecte a propagé le virus, d) l'inactivation complète du virus a recueillis, ANDE) traitement desdites virus inactivé avec du détergent, ce qui entraîne une préparation comprenant des antigènes viraux.

2. La méthode de la revendication 1, dans lequel l'étape de la collecte dit propagé le virus comporte le virus de la séparation desdites cellules et / ou débris cellulaires desdites cellules après l'infection.

3. La méthode de 1, caractérisé en ce que l'inactivation est réalisée par addition du formaldéhyde.

4. La méthode de 1, caractérisé en ce que l'inactivation est réalisée par irradiation UV.

5. La méthode de 1, caractérisé en ce qu'il propage le virus est libéré dans ce fluide.

6. La méthode de 1, où après la collecte du fluide recueillies sont traitées avec une nucléase.

7. La méthode des 6, caractérisé en ce que la nucléase est benzonase.

8. La méthode de la revendication 1, dans lequel lesdites cellules sont sous la forme d'une culture cellulaire pendant ladite propagation des virus.

9. La méthode de la revendication 1, dans lequel lesdites cellules sont des cellules de mammifères et les oiseaux.

10. La méthode de la revendication 1, dans lequel lesdites cellules sont des cellules épithéliales.

11. La méthode de la revendication 8, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules Vero.

12. La méthode de la revendication 1, dans lequel ledit virus est un virus enveloppé

13. La méthode de la revendication 12, caractérisé en ce que le virus est un virus orthomyxo

14. La méthode de la revendication 13, caractérisé en ce que le virus est un virus de grippe.

15. La méthode de la revendication 1, dans lequel la concentration de protéines non virales pendant ladite inactivation est inférieur à 350 pg / ml.

16. La méthode de la revendication 1, caractérisé en ce que la fabrication est sur les montants échelle industrielle.

17. La méthode de la revendication 16, caractérisé en ce que l'inactivation est réalisé sur au moins 11 virus contenant des fluides.

18. Une méthode pour la fabrication d'une préparation comprenant comprisinga antigènes viraux) l'obtention d'un liquide composé de virus infectieux, b) l'inactivation du virus recueillis dit, c) le traitement dudit virus inactivé avec du détergent, andd) de purification dudit virus inactivé résultant dans une préparation comprenant des antigènes viraux.

19. La méthode de la revendication 18, dans lequel ledit fluide est obtenue à partir d'une culture cellulaire.

20. La méthode de revendication 19 comprenant en outre l'étape de la stabilisation a déclaré antigènes viraux.

21. La méthode de la revendication 20, caractérisé en ce que les antigènes viraux sont stabilisés par addition d'une quantité efficace de Tween 80.

22. La méthode de la revendication 21, caractérisé Tween 80 est d'un montant d'environ 0,125%.

23. Une méthode d'augmenter la résistance à une infection virale chez un sujet comprenant la fabrication d'une préparation comprenant des antigènes viraux par l'administration d'une préparation obtenue par l'un quelconque des méthodes de revendications 1-22 à un sujet.
Description

DOMAINE DE L'INVENTION

[0001] La présente invention concerne des méthodes de production de vaccins viraux.

DESCRIPTION DE L'ART CONNEXES

[0002] Un vaccin est une composition immunogène d'une substance antigénique, par exemple la (non-infectieux) des agents pathogènes tels que virus, son enveloppe, de particules ou de ses antigènes protéiques. L'administration ou la vaccination entraîne la vaccination dans un sujet, par exemple un mammifère tel qu'un humain, ou un oiseau. La vaccination peut provoquer une réaction spécifique au vaccin et un peu d'inflammation mineure, mais cela est généralement beaucoup moins d'inconvénients que d'une infection d'un virus pleinement viable qui le vaccin est conçu pour empêcher. Le système immunitaire des sujets s'adaptera à reconnaître spécifiquement les antigènes du vaccin et rapidement inactiver l'agent pathogène, après une nouvelle exposition du sujet à l'agent pathogène. Ainsi, une résistance accrue contre l'agent pathogène est obtenue par la vaccination.

[

0003] Aux fins de vaccin d'un virus est classiquement cultivée sur une culture adéquate des cellules ou un substrat généralement cellulaire. Dans le cas de la grippe, normalement sur oeufs embryonnés de poulet sont utilisées. La récolte virale infectieuse sont recueillis et purifiés pour éliminer les indésirables non-constituants cellulaires du virus. En particulier, dans le cas des vaccins dérivés du poulet substrats réaction allergique au poulet / protéines d'œuf sont possibles chez certains individus sensibles.

[0004] Une étape essentielle dans la production de vaccins viraux est l'inactivation des virus infectieux. Formol (une solution aqueuse de formaldéhyde) est l'agent le plus fréquemment utilisé inactiver dans la fabrication de vaccins. Il est généralement utilisé comme une solution aqueuse saturée avec une concentration d'environ 37% de formaldéhyde. Le formaldéhyde inactiver un virus de façon irréversible par réticulation des groupes amine primaire dans les protéines de surface avec des atomes d'azote autres proches en protéines ou d'ADN grâce à un - CH. Sub.2 dissociation. En particulier, ces liens croisés pourrait conduire à des liens avec des substances non virale et il est donc nécessaire d'effectuer certaines antérieures sur la purification de virus infectieux en direct, puisque avant l'inactivation de purification donnerait lieu à une grande quantité de produits chimiques irréversibles relais entre les protéines virales et impuretés, qui sont préjudiciables à l'efficacité des opérations de purification et de qualité des produits. Pour cette raison, vivent les virus infectieux sont d'abord au moins partiellement purifiés dans l'art antérieur, par exemple par ultracentrifugation zonale, puis inactivés (US Pat. n ° 6048537). L'étape d'inactivation au formol a été validé avec les procédures établies d'analyse.

[0005] En complément de traitement au formol, UV inactivation a été pris en considération pour l'intégration dans le processus de fabrication. L'utilisation de l'irradiation aux ultraviolets-inactivation pour les vaccins à usage humain a été démontrée pour le virus avant unenveloped et enveloppé (US 2006/0270017). Comme le génome viral est plus sensible aux rayons UV nocifs que les antigènes de surface virale, les UV-inactivation a été démontré qu'ils ont peu d'effet négatif sur les caractéristiques biochimiques ou de l'immunogénicité du produit. Les objectifs pour l'inactivation UV sont principalement des acides nucléiques à la différence de protéines qui sont ciblées par le formol.

[0006] En combinant le formol et UV-inactivation, les scientifiques ont essayé de surmonter les limitations des isolés UV-inactivation ou formol-inactivation, respectivement, lorsque l'inactivation du virus, notamment les familles résilientes.

[0007] Par ailleurs, de nombreux fabricants d'utiliser un détergent à base des étapes de processus à la fois à inactiver le virus vivant et de modifier le virus. Ces détergents à base de processus de perturber l'enveloppe lipidique des virus grippaux de céder soit split (partiellement perturbé) ou sous-unité (complètement perturbé) l'antigène vaccinant. Traitement au détergent réduit souvent la réactivité de l'antigène du virus, et réduit ainsi les effets secondaires indésirables lors de la vaccination. Le détergent virus traité mai encore être inactivée par, par exemple, le traitement au formol. Des exemples de ces méthodes de mai se trouve dans le brevet US. N ° 6048573, U. S. Pat. N ° 4522809 et WO 02/09702. Un inconvénient de cette approche est que le virus est soumis à diverses étapes de purification avant l'étape de la perturbation, et ainsi vivre virus infectieux est assurée par le personnel de fabrication à plusieurs étapes. Ceci est particulièrement préoccupante lorsque le vaccin contre les formes particulièrement virulent de la grippe, tels que les souches H5N1, est produite.

RÉSUMÉ DE L'INVENTION

[0008] Il est un objet de la présente invention de fournir un procédé de production de vaccins viraux avec un nombre réduit d'étapes nécessitant la manipulation de matériel infectieux, tout en produisant des antigènes viraux de la réactivité diminué.

[0009] Par conséquent, la présente invention fournit une méthode pour la fabrication d'une préparation comprenant des antigènes de virus comprenant

[0010], une inoculation) des cellules avec des virus infectieux dans un fluide,

[0011] b) propagation dudit virus dans ladite cellule,

[0012] c) la collecte dit propagé le virus dans le surnageant de culture de cellules,

[0013] d) l'inactivation du virus a recueilli, et

[0014] e) le traitement dudit virus inactivé avec un détergent, ce qui entraîne une préparation comprenant des antigènes viraux.

[0015] Dans un deuxième aspect d'une méthode pour la fabrication d'une préparation est prévue comprenant des antigènes viraux comprenant

[0016] a) l'obtention d'un liquide composé de virus infectieux,

[0017] b) inactiver complètement lesdites recueillies virus,

[0018] c) le traitement dudit virus inactivé avec un détergent, et

[0019] d) de purification dudit virus inactivé résultant dans une préparation comprenant des antigènes viraux.

[0020] D'autres aspects de l'invention permettent la préparation de vaccins préparés à partir des antigènes viraux produits selon les méthodes de l'invention.

[0021] Dans un autre aspect de la présente invention fournit la méthode d'augmenter la résistance à une infection virale chez un sujet comprenant la fabrication d'une préparation comprenant des antigènes viraux et d'administrer ladite préparation à un sujet.

DESCRIPTION SOMMAIRE DES DESSINS

[0022] Fig. 1a montre un organigramme de la procédure d'invention de la collection de virus après la propagation à la récolte inactivé.

[0023] Fig. 1b montre une poursuite de la bette à carde logique de la procédure inventive de la récolte inactivé à une préparation en vrac monvalent.

DESCRIPTION DE L'INVENTION

[0024] À condition est une méthode pour la fabrication d'une préparation comprenant des antigènes de virus comprenant

[0025], une inoculation) des cellules avec des virus infectieux dans un fluide,

[0026] b) propagation dudit virus dans ladite cellule,

[0027] c) la collecte dit propagé le virus dans le surnageant de culture de cellules,

[0028] d) inactiver complètement lesdites recueillies virus, et

[0029] e) le traitement dudit virus inactivé avec un détergent, ce qui entraîne une préparation comprenant des antigènes viraux. Au centre de cette procédure est qu'il est possible de réduire le nombre de pas effectués sur un virus actif et donc le virus est inactivé après la collecte de la récolte principale, avant le traitement au détergent et / ou des étapes de purification en option.

[0030] L'antigène «virus», selon la présente invention est un virus ou une partie du virus qui peut induire une réponse immunitaire chez un sujet contre ledit antigène. Réussite absolue dans le sens d'immuniser totalement le sujet n'est pas requise, mais cela doit être comprise dans le sens d'augmenter les défenses immunitaires ou la réponse immunitaire contre ledit virus qui réduit le risque de développer une maladie associée à ladite virus après une nouvelle exposition. Un tel antigène du virus et peuvent, par exemple, s'agir d'un virus entier inactivé, un virus fractionné, un virus modifié, les protéines virales, dans les protéines de surface particulières, comme l'hémagglutinine ou la neuraminidase. Un «vaccin» est une préparation dudit antigène du virus sous une forme pour l'administration, comme par injection, nasale ou de l'administration transdermique. «Purification» selon la présente invention concerne les étapes de la suppression constituants non virale du fluide de la récolte. Le fluide de la récolte obtenue après l'étape de collecte est de préférence un surnageant clarifié, caractérisé solides ou de grandes impuretés, p.ex. autres cellules intactes ou débris cellulaires des cellules infectées qui se brisent en place lors de la propagation du virus, sont éliminés par précipitation, p.ex. par centrifugation. Par conséquent, "la collecte de" se réfère à toute mesure qui produisent ensemble des virus infectieux dans un fluide, en un liquide clair particulier. Outre la suppression des débris de cellule à l'étape de collecte peuvent aussi inclure des mesures pour supprimer d'autres constituants solides de la croissance cellulaire par exemple, à moyen ou un substrat tout type de substrat sur lequel les cellules sont cultivées. Virus entier propagé soit publié dans ledit surnageant de culture cellulaire à partir duquel elle peut être recueillie. Par conséquent, dans une réalisation particulière de l'invention, l'étape de la collecte des virus propagés comprend séparant le virus des cellules et / ou débris cellulaires desdites cellules après l'infection. Cette séparation peut, par exemple, être facilitée par une centrifugation à faible vitesse d'environ 2000 g à 3000 g jusqu'à 5000 g, 10000 g, 15000 g ou 20000 g, ce qui sépare les particules visibles dans le liquide. Alternativement, la séparation mai être effectuée par filtration. En modes particuliers de réalisation préféré dudit fluide est substantiellement exempte d'allantoïne, le collagène et / ou de l'albumine, tels que l'ovalbumine, p.ex. par le choix des cellules utilisées pour la propagation du virus, par exemple cultures de cellules mammifères, les oiseaux ou les insectes au lieu des oeufs embryonnaires. En modes particuliers de réalisation de l'invention, de rein de singe vert d'Afrique (VERO) les piles sont utilisées pour la multiplication virale.

[0031] Après l'étape de la collecte des virus est inactivé par tout moyen connu pour l'inactivation des virus, par exemple telles qu'elles figurent dans le numéro de publication US 2006/0270017 A1, qui sont intégrés aux présentes par renvoi. En particulier, l'inactivation peut être réalisée par un traitement au formaldéhyde et / ou l'irradiation UV, seule ou en combinaison. Tel qu'il est utilisé dans la présente demande ", l'inactivation complète» ou «entièrement inactivés», comme ils se réfèrent à une préparation virale, signifie que la préparation ne contient pas de virus unités formant plages (UFP), tel que déterminé par la culture de la préparation virale sur l'embryon de poulet fibroblastes (CEF) ou des cellules Vero.

[0032] Un des effets bénéfiques des méthodes inventive est la réduction des mesures qui sont effectuées sur des supports virales infectieuses pour lesquelles des mesures de sécurité spécifiques sont nécessaires. Dans l'état de la technique, il a été considéré comme nécessaire d'effectuer une étape de purification sur la récolte principale d'éliminer ou de réduire substantiellement les protéines non virales ou des acides nucléiques qui pourrait contre-lien avec le virus pendant le traitement au formol. Ce préjugé a été surmonté avec la présente invention qui a montré qu'il est en effet possible, voire avantageux pour inactiver directement après la collecte du virus avant la purification. Pour éviter une telle réaction adverse au cours de l'inactivation du virus contenant des fluides, ou de ses constituants non virale, est (sont) de préférence pas davantage concentré ou concentré par un facteur de moins de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 pendant ou après l'étape de collecte. De préférence, la concentration de protéines non virales et / ou de l'ADN du surnageant natif de la culture cellulaire est mis à jour avant l'étape d'inactivation. Dans des réalisations particulières des protéines entières ou non la concentration en protéine virale est de l'ordre de pg / ml, comme inférieure à 950 pg / ml, 900 pg / ml, 850 pg / ml , 800 pg / ml, 700 pg / ml, 650 pg / ml, 600 pg / ml, 550 pg / ml, 500 pg / ml, 450 pg / ml, 400 pg / ml, 350 pg / ml, 300 pg / ml, 250 pg / ml, 200 pg / ml, 150. mu .g / ml, 100 pg / ml, 80 pg / ml, 60 pg / ml, 40 pg / ml, 30 pg / ml, 20. mu.gou inférieur à 1 pg / ml, dans le liquide pendant ou après la collecte d'inactivation du virus.

[0033] Pour l'inactivation n'importe quelle quantité de formaldéhyde ou UV dose d'irradiation peuvent être sélectionnées celles qui sont efficaces pour inactiver le virus, seuls ou en combinaison. Dans un mode de réalisation préféré de la présente demande, la réduction de titre de virus en raison de l'inactivation du virus dans l'échantillon est au moins environ 1.times.10.sup.5, dans un mode de réalisation plus préféré, au moins sur 1.times.10 . sup.7 dans une réalisation plus préférée au moins environ 1.times.10.sup.10, et dans un mode de réalisation préférée au moins environ 1.times.10.sup.14.

[0034] Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'échantillon est traité avec une concentration effective de formol pour environ 12 à environ 96 heures. En modes de réalisation plus préféré, l'échantillon est traité avec une concentration effective de formol pour environ 24 à environ 48 heures, et plus préférentiellement pour environ 24 à environ 30 heures. Dans un mode particulièrement préféré de la présente invention, l'échantillon est traité avec une concentration effective de formol pour environ 24 à environ 24,5 heures. Ceux d'habileté dans les arts vaccin ne reconnaissent que la concentration de formol et de temps de traitement mai doivent être optimisés pour la souche particulière du virus traité afin de réaliser l'inactivation complète, se fanent, seul ou en combinaison avec de la lumière UV. Dans un autre mode de réalisation de l'étape de traitement de l'échantillon avec une concentration effective de formol est effectué à environ 10 à environ 40 °. C. Dans un mode particulièrement préféré de la pré-senter la demande de l'étape de traitement de l'échantillon avec une concentration effective de formol est effectuée à environ 32.degree. C.

[0035] Une variante préférée de la présente invention comprend le traitement de l'échantillon avec une concentration effective de formol, dans lequel la concentration effective de gammes de formol de préférence d'environ 0,01% à environ 1% (w / w), de préférence d'environ 0,01% à environ 0,1% de plus de préférence entre environ 0,025% et environ 0,1% ce qui correspond à environ 92 mg / l et environ 368 mg / l respectivement formol lorsque vous utilisez une solution de formol à 37% pour ajuster la concentration efficace.

[0036] Dans la présente demande le terme "UV": le rayonnement ultraviolet dont la longueur d'onde de 100 à 400 nm. La lumière UV mai être choisi parmi le groupe constitué par UV C (100 à 280 nm), UV B (280 à 320 nm) et UV A (320 à 400 nm). Agents photosensibilisants comme ceux qui s'intercalent dans l'ADN et sont activés par la lumière UV, par exemple psoralènes, mai être utilisé pour améliorer l'effet de l'inactivation du rayonnement UV. Dans un mode préféré de l'invention présentent les rayons UV sont les UV C de longueur d'onde d'environ 100 à environ 280 nm. Dans un mode de réalisation plus préféré de la présente invention la lumière UV a une longueur d'onde d'environ 240 à environ 290 nm. Dans un mode particulièrement préféré de l'invention, présente environ 85% ou plus de la lumière UV ont une longueur d'onde d'environ 254 nm.

[0037] L'émission de lumière UV mai être une forme continue de l'émission de lumière UV, par exemple la technologie des lampes au mercure, ou la lumière pulsée UV, par exemple la technologie laser monochromatique. L'intensité du rayonnement UV mai désiré être générés par la combinaison de deux ou plusieurs feux. L'objet de l'invention englobe toute la dose efficace de la lumière UV, à savoir toute la dose de rayons UV qui inactive de façon sécuritaire un virus donné de préférence, lorsqu'il est combiné avec un traitement au formol. Ceux d'habileté dans les arts vaccin ne reconnaissent que les UV de longueur d'onde de lumière et de l'exposition mai doivent être optimisés pour la souche particulière du virus traité afin de réaliser l'inactivation complète, soit seul ou en combinaison avec un traitement au formol. La dose efficace mai dépendent d'une variété de facteurs qui sont généralement connus dans le domaine, par exemple les paramètres physiques des chambres d'inactivation UV tels que la taille et le diamètre de la lampe et la chambre, la distance entre le virus contenant le milieu et la source de lumière UV, absorption de la lumière et les propriétés de réflexion du matériau de la chambre. Dans le même ordre d'idées, la longueur d'onde et l'intensité de la lumière UV C ainsi que le temps de contact avec le virus est exposé à la lumière UV est également critique pour la dose efficace. En outre, la dose efficace est également influencée par le virus lui-même, le milieu contenant le virus et de leurs propriétés d'absorption de la lumière. De préférence, la dose efficace est suffisante pour inactiver d'au moins 99,99% des virus contenus dans l'échantillon, plus préférentiellement inactiver le virus à un niveau où aucun virus actif est détecté dans un test de mammifères et les oiseaux de culture cellulaire, ou complètement inactivé. Dans un mode de réalisation préféré utiliser la lumière UV C un échantillon contenant le virus soit exposé à une dose efficace variant d'environ 5 à environ 200 mJ/cm.sup.2. Dans un mode de réalisation préféré, la dose efficace est de l'ordre d'environ 20 à environ 100 mJ/cm.sup.2, et dans d'autres modes de réalisation préféré, la dose efficace dans la gamme d'environ 40 à environ 90 mJ/cm.sup.2. Dans un mode de réalisation préféré, la dose efficace réduit un titre de virus initiale par 1.times.10.sup.5. Dans l'inactivation du vaccin en vrac, la dose efficace devrait être suffisant pour éliminer tout virus vivants résiduels qui mai être présent après le produit chimique (formol) étape d'inactivation. Comme illustré dans les exemples, ce mai être déterminée par des essais de cellules de mammifères très sensible l'infection de la culture, comme le test de culture de cellules Vero décrit dans l'exemple 1.3.

[0038] Après inactivation des antigènes de virus sont purifiés. La purification est réalisée de préférence par ultracentrifugation à par exemple dans la gamme d'environ 100000 g tels au moins 50000 g, 60000 g, 70000 g, 80000 g, soit 90,000 g, ou jusqu'à concurrence de 200000 g, 180000 g, 160000 g, 140000, G 120000 ou 110000 g g. La méthode d'ultracentrifugation est communément connu dans l'art et est utilisé dans la fabrication habituelle de vaccins viraux comme par exemple décrit dans le brevet S. U.. N ° 6048537, qui est donc incorporé par référence. De préférence, l'ultracentrifugation est réalisée dans un gradient de densité de saccharose qui s'établit au cours de la centrifugation. En particulier modes de réalisation préférés du gradient de saccharose est formée par l'aide d'une solution d'environ 42% à 55% (% w/w-) de saccharose (ou tout autres suffisantes de glucides ou de sucre connus dans l'art). Par ultracentrifugation une centrifugeuse à flux continu mai être utilisés. Les paramètres de fractionnement après ultracentrifugation sont dépendantes des caractéristiques des souches de virus utilisées. Les paramètres pour la collecte de la fraction de pic de la piscine sont évalués et déterminés individuellement pour chaque souche de virus et qui sont dans la fourchette de l'ordre de 46-50% à 34-38% de saccharose. De préférence des matériaux non viraux (par exemple, à ce stade de virus inactivés ensemble) sont éliminés par séparation par densité. Fragments de membrane cellulaire, y compris les liposomes et les protéines ont chacun un poids spécifique caractéristique. Les virus comme étant une composition caractéristique des protéines, des acides nucléiques et dans le cas des virus enveloppés de membrane peut être purifié par leur densité spécifique du matériel non virale. En particulier, l'ensemble des antigènes viraux mai être purifié à partir des parties du virus incomplète, ou vice versa.

[0039] Cette étape de purification du virus inactivé comprend au moins partiellement solubles et non la suppression matières virales contre le virus. En particulier le non-solubles matériel viral comprend les protéines cellulaires ou de la cellule des acides nucléiques à partir de la cellule du milieu cellulaire d'origine ou la culture. Les matières non virales, y compris le virus de portions incomplètes, est de préférence réduite d'un montant d'au moins 20%, de préférence au moins 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65 %, 70%, 75%, 80%, 85% ou au moins 90% durant la purification.

[0040] Dans modes particuliers de réalisation préféré le liquide recueilli est traité avec une nucléase de dégrader les acides nucléiques des cellules hôtes. Une telle nucléase peuvent par exemple être benzonase.

[0041] Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, les cellules utilisent pour la culture cellulaire et à la propagation virale mai s'agir de cellules primaires ou de toute ligne de cellules de culture aptes à la production du virus. Exemples de cellules qui mai être utilisés comprennent les cellules de mammifères (par exemple, CHO, BHK, Vero, HeLa, ou PERC6 cellules), les cellules aviaires (par exemple, les fibroblastes d'embryons de poulet ou de lignées cellulaires continues d'un virus aviaire) et les cellules d'insectes (par exemple, Sf9 cellules.). En modes particuliers de réalisation préféré, les cellules sont en forme de culture cellulaire. Le procédé de l'invention permet de purification efficace, y compris le fractionnement de la matière en dépit de la croix potentiels reliant les propriétés des réactifs inactivation précédente. Contrairement aux virus cultivé sur des œufs, de la culture de cellules dérivées du virus est d'une plus grande pureté initiale et est libre de l'albumine et les collagènes, ce qui représente un avantage important pour la purification de l'formolé récolte. La formule novatrice du produit qui en résulte est libre de floculation, sans aucun besoin de stabilisants tels que tocophérol ou laureth-9.

[0042] Dans la présente invention, les virus d'être inactivés sont choisis parmi enveloppé d'ADN ou des virus à ARN, avec simple ou double (ADN) génomes brin sens ou antisens, continu ou fragmenté. En modes de réalisation préférés de l'invention, les virus sont sélectionnés dans le groupe des virus enveloppés, y compris, flavivirus, togavirus, les rétrovirus, les coronavirus, filovirus, rhabdovirus, bunyavirus, orthomyxovirus, paramyxovirus, arénavirus, hépadnavirus, herpèsvirus et les poxvirus. En d'autres modes de réalisation préféré, les virus sont flaviruses, les coronavirus, orthomyxovirus ou togavirus. Particulièrement préférés sont des virus enveloppés tels que la grippe, y compris les souches de l'influenza A, B ou C, West Nile, virus et Ross River (RRV.) Dans d'autres modes de réalisation préférée de l'invention, les virus sont sélectionnés dans le groupe des virus ARN à enveloppe, y compris, flavivirus, togavirus, les rétrovirus, les coronavirus, filovirus, rhabdovirus, bunyavirus, orthomyxovirus, paramyxovirus, et arénavirus. Dans une réalisation particulièrement préféré, le virus est choisi parmi les orthomyxovirus, par exemple, une souche de virus de la grippe: les souches du virus de la grippe mai ont des combinaisons variées de hemaglutianin et des protéines de surface de la neuraminidase. Dans un autre exemple particulièrement préféré, le virus est choisi parmi les togavirus, par exemple d'un alphavirus tels que le RRV) Un autre groupe préféré de virus pour les utiliser comme solution virale en vrac sont des coronavirus, y compris le virus associé au syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS ). Un autre groupe de virus préférés sont les flavivirus, comme l'encéphalite japonaise, encéphalite à tiques en phase aqueuse (TBE), virus de la dengue, la fièvre jaune fièvres virus, virus du Nil occidental et le virus de la fièvre hémorragique. Un autre groupe préféré de virus sont les poxvirus, notamment orthopox virus (tels que les virus de la vaccine ou de modification de la vaccine Ankara), et avipoxvirus.

[0043] Dans d'autres modes de réalisation du virus purifiés sont traitées ultérieurement. Après des étapes de purification supplémentaires peuvent comprendre la dilution du virus purifié, en particulier après ultracentrifugation de saccharose, afin de diluer la fraction visqueux pic piscine qui est censé contenir environ 40% de saccharose. Le virus purifié peut être homogénéisée, en outre, la nucléase de traités, de pression et / ou ultra / diafiltré.

[0044] dans les réalisations de l'invention, le virus est modifiée par un traitement détergent pour produire un virus entier ou divisé modification de virus vaccinal. La modification de l'enveloppe lipidique du virus est réalisé par solubilisation avec un détergent comme le Triton X100 à une concentration appropriée à déstabiliser ou à désintégrer les virus, en particulier la membrane lipidique virale enveloppe. Le traitement détergent au moins en partie enlever la membrane de ce virus. De préférence la concentration de détergent, par exemple par diafiltration ou procédés chromatographiques. Détergents pour utilisation dans l'étape de traitement comprend un détergent ionique (cationiques, anioniques, zwitterioniques), des détergents ou des détergents non ioniques. Convient détergents notamment le groupe Tween des détergents (par exemple, le Tween 80), et le groupe Triton des détergents (par exemple, Triton 100.)

[0045] Optionnellement, la préparation d'antigène viral est ensuite stabilisés par un traitement au formaldéhyde supplémentaires ou plus stabilisateur tel que par l'usage de détergents qui est divulgué dans WO 02/097072 l'A2 qui est incorporé aux présentes par référence. Ces détergents sont des détergents exemple approprié pour stabiliser la protéine HA, tels que le Tween 80, Triton X100, désoxycholate, Laureth-9 et tocophérol. On pense que les protéines de surface sont conservées solubilisé par des micelles complexes de constituants de la membrane et les détergents.

[0046] En particulier modes de réalisation préférés du virus est ensuite transformé à un virus fractionné comprenant l'une des étapes suivantes de la dilution, l'homogénéisation, le traitement nucléase, filtration sous pression, ultra / diafiltration, solubilisation, diafiltration, la stabilisation par un traitement au formaldéhyde, la dilution, ultra / diafiltration, (détergent) l'addition stabilisateur, une homogénéisation des deuxième et la filtration stérile.

[0047] Dans d'autres modes de réalisation particulièrement préféré le virus est ensuite transformé à une préparation de virus comprenant toute modification de l'une des étapes suivantes de la dilution, l'homogénéisation, le traitement nucléase, filtration sous pression, un traitement détergent, Ultra / diafiltration, outre le stabilisateur, une homogénéisation des deuxième et filtration stérile. En particulier la stabilisation de détergent est effectuée afin de mettre en place un détergent dans la membrane virale dans le cas des virus enveloppés à accroître la stabilité du virus complet, qui est donc modifié.

[0048] Dans d'autres modes de réalisation du virus est traitée à un sous-vaccin unité comprenant l'isolement des sous-unités virales ou unique de protéines virales, en particulier des protéines de surface comme heamaggutinin ou la neuraminidase. L'isolement peut par exemple être effectuée par purification d'affinité et / ou des méthodes chromatographiques, comme la chromatographie par échange d'ions.

[0049] Curieusement la méthode de la présente invention est adaptée à la production industrielle de vaccins contre le virus de l'antigène. Donc de préférence l'inactivation ou de toute autre démarche, comme l'inoculation, la propagation de la collecte ou la purification est réalisée sur les montants ou les rendements des montants d'au moins 0,51, 11, 21, 31, 41, 51 61, 71, 81, 91, 101 , 121, 141, 161, 181, 201, 251, 301, 351, 401, 601, 801, 1001, 1201, 1401, 1601, 1801, 2001, d'un fluide comprenant un virus ou un antigène viral.

[0050] Dans un autre aspect de la présente invention concerne également un procédé pour la fabrication d'une préparation comprenant des antigènes viraux comprenant

[0051] a) l'obtention d'un liquide composé de virus infectieux,

[0052] b) inactiver complètement lesdites recueillies virus,

[0053] c) le traitement dudit virus inactivé avec un détergent,

[0054] d) de purification dudit virus inactivé résultant dans une préparation comprenant des antigènes viraux. Bien sûr, il est également possible d'utiliser des virus infectieux contenant des fluides en soi, qui peut être de toute surnageant cellulaire tel que décrit ci-dessus, pour l'inactivation, de traitement de détergents et de purification. De préférence ledit fluide comportant des virus infectieux est obtenue à partir d'une culture cellulaire.

[0055] En particulier les modes de réalisation préférés antigènes du virus, en particulier du virus fractionné ou des antigènes de virus modifiés, sont stabilisées par addition d'une quantité efficace de Tween 80, en particulier préférée à une concentration d'environ 0,125%, par exemple supérieure à 0,01%, 0,05% ou 0,4%, et inférieur à 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, soit 0,2%. Par conséquent, la présente invention prévoit également, dans un autre aspect de la méthode de stabilisation des antigènes viraux par addition de Tween 80. Selon la présente invention, il a été constaté que, comme un détergent Tween 80 est moins puissant pour solubiliser les membranes virale que le Triton X100, mais est de loin plus biocompatibles et peut être présente dans une préparation vaccinale. La quantité efficace pour stabiliser les antigènes viraux est de préférence inférieur au montant de solubiliser les membranes virales comme dans la procédure du virus fractionné solubilisation à l'aide de fortes concentrations de Triton X100, par exemple, 0,5%. Dans d'autres réalisations les antigènes viraux, sont exempts de stabilisants.

Par exemple

En modes particuliers de réalisation d'une production d'un vaccin partagé est fournie par un processus où la récolte de virus est totalement inactivés avant le fractionnement et de purification. Étonnamment, le procédé d'inactivation d'un traitement au formol et traitement des UV n'interfère pas avec le traitement ultérieur de détergent et de purification.

[0056] Dans d'autres modes de réalisation d'un vaccin ou une composition pharmaceutique est fourni, qui comprend un ou plusieurs antigènes viraux. Une telle composition pharmaceutique peut comprendre en outre un support pharmaceutique et / ou un adjuvant. Ces transporteurs pharmaceutiques sont par exemple la stabilisation de sels, des émulgateurs, solubilisants ou osmo-régulateurs, agents de suspension, des agents épaississants, des composants redox le maintien d'un potentiel d'oxydoréduction physiologiques. Pré-adjuvants transféré comprennent les sels d'aluminium, les microémulsions, les particules lipidiques, et / ou des oligonucléotides utilisés pour augmenter la réponse immunitaire. Un autre aspect de la présente invention est une composition pharmaceutique ou de la préparation que le vaccin comprenant un antigène. Un vaccin peut être utilisé par exemple pour une injection comme moyen prophylactique contre un virus associé à la maladie. En modes particuliers de réalisation préférée de la composition ou vaccin comprend plus d'un antigène, par exemple 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, en particulier des différentes souches de virus, sous-types ou des types tels que l'influenza A et B de l'influenza, en particulier choisi parmi un ou plusieurs des H1N1 de l'homme, H2N2, H3N2, H5N1 , H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, sous-types H10N7, du H1N1 de la grippe porcine, H1N2, H3N1 et sous-types H3N2, du chien ou du H7N7 de la grippe du cheval, sous-type H3N8 ou H5N1 aviaire, H7N2, H1N7, H7N3, H13N6 , H5N9, H11N6 H3N8, H9N2, H5N2, H4N8, H10N7, H2N2, H8N4, H14N5, H6N5, H12N5 sous-types.

[0057] adjuvants appropriés peuvent être choisis à partir de gels minéraux, de l'hydroxyde d'aluminium, les substances tensio-actives, lysolécithine pluronique polyols, polyanions ou des émulsions de pétrole tels que l'eau dans l'huile ou huile dans l'eau, ou une combinaison des deux. Bien sûr, le choix de l'adjuvant dépend de l'usage prévu. Par exemple mai toxicité dépendent de l'organisme sous réserve destinée et peuvent varier d'aucune toxicité à forte toxicité.

[0058] Une autre forme de réalisation préférée de la composition ou le vaccin de la présente invention comprend en outre des substances tampon. Substances tampon peut être choisi par l'artisan qualifié pour établir l'état physiologique dans une solution de la composition selon l'invention. Biens immobiliers tels que le pH et la force ionique ainsi que le contenu d'ions peuvent être choisis comme souhaité.

[0059] Une composition préférée supplémentaires ou vaccin selon l'invention, comporte un support pharmaceutiquement acceptable.

[0060] Le terme «transporteur» désigne un diluant, par exemple l'eau, solution saline, d'excipient, ou d'un véhicule dont la composition peut être administrée. Pour une composition solide, les transporteurs dans la composition pharmaceutique mai comporter un liant, comme la cellulose microcristalline, la polyvinylpyrrolidone (polyvidone ou povidone), la gomme adragante, la gélatine, l'amidon, lactose ou du lactose monohydraté; un agent de désintégration, tels que l'acide alginique, amidon de maïs et articles similaires; un lubrifiant ou un surfactant, comme le stéarate de magnésium ou de sodium lauryl sulfate, un Glissant, comme le dioxyde de silicium colloïdal, un édulcorant, comme le saccharose ou saccharine.

[0061], sont également fournis la méthode d'augmenter la résistance à une infection virale chez un sujet comprenant la fabrication d'une préparation comprenant un ou plusieurs différents antigènes viraux et de l'administration a déclaré une préparation comprenant un ou plusieurs antigènes viraux, comme décrit ci-dessus à un sujet. La préparation est de préférence un vaccin. Il est également envisagé de fournir les antigènes du virus tel que préparé par la présente invention comme un vaccin ou pour augmenter la résistance à une infection virale chez un sujet en administrant lesdits antigènes du virus.

EXEMPLES

Exemple 1

Inactivation of Infectious Virus

[0062] Trois différentes souches grippales, deux souches A-Hiroshima (RH, H3N2), un nouveau Calcdonia (NC, H1N1) et un B-souche, la Malaisie (MA), ont été produites dans des cultures de cellules Vero. Après la diffusion de virus de la récolte de virus infectieux est inactivé avant de purification tel qu'il figure dans l'organigramme de la figure. 1 bis.

[0063] 1.1. L'inactivation de formol

[0064] La première étape d'inactivation au formol est effectué sur une cellule-libre, la récolte du virus infectieux monovalents, soit une récolte du bioréacteur après clarification par centrifugation. Après la collecte de 30 à 34.degree. C, la récolte du virus monovalent est traitée avec environ 0,9 à environ 1,1 U / Benzonase ml à 30 à 34.degree. C pendant 4 à 8 heures. Puis il est traité avec <= 92 mg / l pour le formol de 24 à 24,5 heures à 32 + /-2.degree. C.

[0065] 1.2. UV inactivation

[0066] Un certain nombre d'expériences avec du formol inactivation des virus inactivés sont effectuées en utilisant une chambre d'inactivation, avec une lampe UV 65 W et une chambre de couche mince. Alors que l'inactivation complète de la récolte du virus monovalent peut être démontrée lors de l'utilisation des débits de 100 litres par heure pour les trois cycles, cette configuration ne permet pas le sur-mesure en ligne de signal UV. La culture de cellules Vero support utilisé pour la production de l'influenza contient divers composés organiques responsables de l'absorption du signal UV. Par conséquent, le système est équipé d'une lampe W 110 permet une surveillance continue du signal UV pendant le traitement du virus monovalent récolte.

[0067] formolé monovalent influenza récolte Panama est utilisé comme substrat modèle pour l'inactivation. Pour l'inactivation continue avec la technologie de couche mince UV une WEDECO VISA système (Allemagne) équipé d'une lampe VISA (110 W) est utilisé. La mince couche de chambre UV est un acier inoxydable 1.4435 appareil avec un diamètre de 30 mm tube de quartz. Un calibrée d'un capteur UV permet le contrôle en ligne du signal UV. La mince couche de chambre UV fonctionne à un débit de 240 + / -10 litres par heure à température ambiante. Les conditions de débit sont contrôlés par un débitmètre calibré. La récolte monovalent est exposé à 10 cycles UV. Après chaque cycle de 20 litres du traité anti-UV récolte monovalent est enlevé et purifiée par gradient de sucrose de purification utilisant ultracentrifugation continue.

[0068] 1.3. Safety Test

[0069] La norme de Vero test de sécurité est un test très strictes de qualité pour l'infectiosité résiduelle des souches d'influenza inactivé. Le test est également applicable à d'autres virus. Un produit monovalent en vrac, soit l'antigène du virus purifié après centrifugation en gradient de saccharose et ultra-diafiltration, est ajoutée à 5 boîtes de Roux (4 ml / flacon). Après incubation pendant 7 jours à 32.degree. C. à Vero milieu de culture, les cultures de cellules sont récoltées, mises en commun et ajoutés à 5 boîtes de Roux (10 ml / flacon). Après une autre étape d'incubation pendant 7 jours à 32.degree. C., des cultures de cellules sont récoltées, mises en commun, et testés pour l'hémagglutinine (HA).

[0070] L'AP-test est basé sur le fait que les virus de la grippe peuvent se lier érythrocytes en utilisant leur hémagglutinine protéine de surface. L'essai est réalisé dans un environnement stérile. Une suspension de virus de la grippe avec un titre HA définie sert de contrôle positif et une solution de NaCl 0,9% sert de contrôle négatif. 50. Mu.l d'une dilution 1:2 dans NaCl 0,9% d'un échantillon à tester sont donnés dans un puits d'une plaque de 96 puits. Pour chaque puits 50. Mu.l d'une solution contenant des érythrocytes de poulet est ajoutée. Par la suite, les plaques sont incubées pendant 30 à 45 minutes à température ambiante. Puis le hémagglutination est visuellement déterminé, dans lequel, si cinq puits contenant le même échantillon ne présentent pas de l'hémagglutination, l'échantillon a passé le test HA.

Exemple 2

Purification par ultracentrifugation

[0071] Au cours de la purification de l'antigène du virus de la grippe, la récolte monovalent (MVH) est concentré par centrifugation. Une procédure à flux continu de centrifugation peut être appliquée pour la fabrication de la culture de cellules Vero cultivées vaccin viral basé sur un gradient de saccharose formé à l'aide d'une solution aqueuse de saccharose. Le modèle de centrifugeuse utilisée était équipée d'un preclarifier. Expériences à petite échelle avec un gradient de densité formé à l'aide env. 42% et 55% (p / p) une solution de saccharose dans 20 mM Tris-buffer ont été réalisées sous différentes conditions de centrifugation. En outre, ultracentrifugation sans preclarifier mais avec l'augmentation des forces g s'est avéré être un outil précieux pour l'amélioration des rendements.

[0072] monovalent récoltes virus de l'influenza (MVHs) ont été utilisés pour les études comparatives. Le MVHs ont été purifiées par ultracentrifugation continue avec une centrifugeuse de laboratoire modèle RK-6 à 35.000 tr / min.

Exemple 3

Purification / traitement

[0073] Pour un candidat vaccin contre la grippe, trois différentes souches de la grippe ont été purifiées et recueillis dans ultracentrifugation comme décrit dans l'exemple 2. Antigène rendements étaient différents dans les Portefeuilles de Peak. La nouvelle souche grippale Calcdonia avait le plus faible rendement de l'antigène suivie par Hiroshima et finalement la Malaisie. La teneur en protéines est plus élevée dans la Malaisie et les plus bas de l'Hiroshima. SRD (single radial immunodiffusion assay (HA-quantification)) à des taux de Protéine totale étaient comparables dans Peak Piscines de la Malaisie et la Nouvelle-Calcdonia, mais plus élevé dans le Hiroshima (tableau 1).

Nous Table-00001-TABLEAU 1 Les résultats d'analyse des bassins de pointe HR05/61 MA04/61 NC99/51 souche d'influenza Hiroshima Malaisie Nouvelle-Calédonie Montant (ml (g)) 840,4 (1000) 420,2 (500,1) 420,2 (500) SRD (. Mu .g / ml) 246,2 426,6 194,9 conc Protein. 487 1495 764 (pg / ml) de Bradford SRD / protéines 0,51 0,28 0,26 VERO conc Protein. 6,2 19,7 18,9 (pg / ml) par ELISA

Un traitement ultérieur est fonction de la présentation suivante:

[0074] 3.1. Dilution de Peak Pools

[0075] Les Piscines Peak sont dilués 3 fois avec du tampon TBS pour réduire la concentration de saccharose pour la réduction de la viscosité.

[0076] 3.2. Première homogénéisation Peak Pool

[0077] Le diluée Peak Pool est traitée avec un homogénéisateur à haute pression "NS 1001L Panda" (Niro Soavi SpA). La suspension de virus est passé à travers l'homogénéisateur 3 fois avec 800 bar. Cette pression est suffisante pour améliorer certaines étapes du traitement ultérieur en perturbant les agrégats de virus.

[0078] 3.3. Benzonase adjonction

[0079] Benzonase, une nucléase recombinante produite dans E. coli, est ajouté à la suspension de virus à une concentration finale de 3 UI / ml à dégrader l'ADN de la cellule.

[0080] 3.4. Pressure Filtration

[0081] Après l'addition Benzonase, un 0,22. Um filtration sous pression est effectuée afin de maintenir la suspension de virus gratuit advantitious d'organismes comme les bactéries au cours de la période d'incubation subséquentes. L'incubation est effectuée à 32.degree. C. pendant la nuit.

[0082] 3.5. Ultra / diafiltration

[0083] Après une incubation Benzonase est terminé, Ultra / diafiltration est réalisée avec une membrane de 30 kD suspendue chaîne d'ultrafiltration (Pall) avec une surface de filtration de 0,1 m.sup.2 à petite échelle et 0,5 m2 à l'échelle pilote. Le Ultraretentate est diafiltré avec 10 volumes Rétentat de TBS (Tris buffered saline) 0,008 TritonX100% (w / w).

[0084] 3.6. Triton X100 adjonction de solubilisation et incubation

[0085] Pour le fractionnement Virus, TritonX100 est ajouté à une concentration finale de 0,5% (p / p) et incubées pendant une nuit à température ambiante.

[0086] 3.7. Diafiltration II

[0087] Pour le retrait de la forte concentration de Triton X100, diafiltration est réalisée avec une membrane de 30 kD suspendue chaîne d'ultrafiltration (Pall). Le Ultraretentate est diafiltré avec 15 volumes de rétentat de TBS (Tris saline tamponnée).

[0088] 3.8. Addition de formaldéhyde et d'incubation

[0089] Le formol est ajouté dans le dossier / Ultra Diaretentate à une concentration finale de 0,025% pour la stabilisation d'antigène. L'incubation est réalisée pendant 18-24 heures à température ambiante. Le formol est une solution aqueuse saturée d'. About.36 gaz-37% de formaldéhyde.

[0090] 3.9. Triton X100 Détermination de concentration par HPLC

[0091] Dans les étapes suivantes consistent en une étape de dilution et un Ultra supplémentaires / diafiltration. Afin d'être en mesure de diluer l'UDR-dessous de la CMC pour Triton X 100 (TX 100,. About.0.015%, 250. PM, en solution aqueuse), une analytique TX 100 étape de détermination a été introduit pour définir la concentration de TX 100. Le facteur de dilution dépend de cette concentration de 100 TX.

[0092] 3.10. Dilution de l'UDR-dessous de la concentration micellaire critique pour TX 100

[0093] Le / Ultra Diaretentate contenant résiduelle TX 100 de l'ordre de 0,1-0,2% (déterminée par HPLC) est dilué avec le SCT à une finale TX 100 concentration de 0,008%, une concentration nettement en dessous de la CMC (concentration micellaire critique).

[0094] 3.11. Ultra / diafiltration III

[0095] Ultra / diafiltration est réalisée à l'identique 30 kD suspendue membrane d'ultrafiltration canal. Le Ultraretentate est diafiltré avec 5 volumes Rétentat de TBS (Tris buffered saline) +5 VC TritonX100 SCT 0,008% (w / w).

[0096] 3.12. Détergent de stabilisation

[0097] Après la réduction de la concentration de 100 TX vers le niveau cible, le Tween 80 est ajouté dans la suspension à une concentration finale de 0,125 %.+-. 0,025% pour poursuivre la stabilisation d'antigènes du virus. Cela évite de ré-agrégation de l'antigène en raison de trop faibles concentrations TX 100.

[0098] 3.13. Deuxième Homogénéisation

[0099] Une deuxième étape de haute pression d'homogénéisation est effectuée pour maintenir la perte de l'antigène faible à la 0.22. Étape de filtration um. L'homogénéisateur mêmes que celles décrites à la section 3.2 avec un paramétrage identique est utilisé.

[0100] 3.14. Filtration stérile

[0101] Suite à la 2ème marche homogénéisation une filtration stérile est réalisée à l'aide 0.22. Filtres um (Millipore). Le stérile filtrée matière en vrac est appelé monovalent en vrac (MVB).

Exemple 4

Résultats

TABLE-US-00002 [0102] TABLEAU 2 Résultats de la purification après ultracentrifugation à l'exemple d'un virus split (Hiroshima): Peak DIL UDR1 UDR2 piscine (1:3) HOM1 PFIL 30Ko 30Ko UDR HOM2 MVB Montant g 500 1501,6 1479,8 1537,5 410,4 411,7 421,8 414,9 421,5 OD densité optique, 405 nm / 0,82 0.24 0.20 0.86 0.72 0.88 0.18 0.15 SRD (NIBSC) pg / ml 194,9 58,7 56,1 52,9 130,9 110,3 84 86,5 74,6 Total 81,9 mg SRD 77.4 78.2 73.9 53.7 45.4 35.4 35.9 31.5 Protéines pg / ml 764 / / / / / / / 385 mg de protéines totales 382 / / / / / / / 162,3 VERO pg de protéines / ml 18,9 4,5 4,4 3,8 10,8 6,3 4 5 4,7 conc. par ELISA Total VERO mg 8 6.1 5.9 5.2 4.4 2.6 1.7 2.1 2 protéines par ELISA ADN Vero ng / ml / / / / / / / / 0,64 Vero total de l'ADN. mu.g / / / / / / / / 0,27 TX100 (% ) / / / / 0,482 0,101 0,018 0,017 0,017 Tween80 (%) / / / / / / / / 0.115 DIL (1:3). . . dilution de peakpool; UDR. . . Ultradiaretentate après ultradiafiltration; CDM-1, CDM-2. . . homogénéisation 1 et 2; PFIL. . . 0,22. Pression um-filtration; MVB. . . monovalent en vrac

Le SRD total dans le MVB a été de 73 mg. Total des teneurs en protéines Vero ont été réduites de 5,2 mg à 1 mg, une réduction de 80,8%. Total Vero ADN a été ramené à 0,28. Mu.g dans le MVB. Protéine totale a été réduite de 487 mg à 212 mg constituant une réduction de 56,5%.

[0103] Des résultats similaires ont été obtenus pour la souche Malaisie: Total protein Vero pourrait être réduit de 8,3 mg à 2,4 mg, qui est une réduction d'environ 67,5% de la réserve de pointe vers les MVB. Vero contenu en ADN dans le MVB était de 1,8. Mu.g. Réduction du total des protéines durant la purification a été de 58,6% de 748 mg à 310 mg.

[0104] Pour la souche Calcdonia neuf à la fin de la purification, les protéines totales Vero pourrait être réduit de 8 mg dans le pool en période de 2 mg le MVB, qui est une réduction de 75%. Total Vero contenu en ADN dans le MVB était de 0,27. Mu.g. Protéine totale a été réduite de 382 mg dans le Pool pic à 162 mg le MVB, qui constitue une réduction de 57,6%.

[0105] Le procédé de purification est très cohérente et solide. Une préparation hautement purifiée virus résulté de la réduction efficace de la protéine de la cellule hôte et de l'ADN ainsi que des produits chimiques industriels comme Benzonase, saccharose, le formaldéhyde et le Triton X100, ainsi que l'absence d'endotoxines. Toutes les préparations étaient stériles après la production. SRD à des taux de protéines étaient conformes aux spécifications dans les trois MVBs.

Puisqu il est apparu en 2009 AU MEXIQUE pour la première fois
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