Les Vaccins produits par Génie Génétique

[color=blue]Les techniques de l'ADN recombinant sont utilisées pour modifier le génome des êtres vivants (végétaux, animaux, micro-organismes) dans le but de changer leurs caractéristiques physiques, physiologiques, métaboliques. Il est ainsi possible d'utiliser des micro-organismes génétiquement modifiés pour produire des substances biologiques à usage thérapeutique ainsi que des vaccins. Cette technique a permis de fabriquer des vaccins au patrimoine génétique chimérique en insérant des gènes, codant pour des protéines reconnues par le système immunitaire, dans des micro-organismes supports. Des vaccins sont ainsi fabriqués pour les animaux, par exemple contre la rage, la peste bovine, la leucose bovine, la maladie de Newcastle des volailles. De tels vaccins chimères ont également été conçus pour l'homme. Un vaccin contre les rotavirus, responsables de nombreuses diarrhées à travers le monde, a été obtenu en associant des gènes humains à une souche simienne de rotavirus. Mis sur le marché aux Etats-Unis, il a été retiré en catastrophe parce que les nourrissons étaient atteints de diverticulose. Mais l'exemple le plus connu des vaccins recombinants est celui des vaccins anti-hépatite B (GenHevac B®, Engerix B®, HBVax DNA® ou Recombivax®). La technique consiste ici à faire produire, par un système cellulaire, la protéine de surface du virus de l'hépatite B (HBs) grâce à un plasmide recombinant introduit dans ces cellules.

Cas du GenHevac B®

Le plasmide recombinant (désigné par pSVS dhfr) comprend :
- Le plasmide support : plasmide de Bolivar et Rodriguez (pBR322) provenant de Escherichia coli et comportant son origine de réplication et un gène de résistance à l'ampicilline,
- Le gène S du virus de l'hépatite B (avec la séquence pré-S2), placé sous le contrôle du promoteur fort du virus simien SV40,
- Le gène marqueur dhfr, permettant la synthèse de la dihydrofolate réductase, placé sous le contrôle du virus de la tumeur mammaire de la souris (MMTV),
- Ce plasmide est ensuite cloné dans des bactéries, le gène de résistance à l'ampicilline permettant de trier les bactéries ayant incorporé les plasmides.

Transfection et expression des plasmides
Les plasmides sont ensuite transfectés dans des cellules de lignée continue CHO dhfr- (issues d'ovaire de hamster de Chine et déficientes en dihydrofolate réductase). Après transfection, les cultures cellulaires sont traitées par le méthotrexate. Les cellules ayant incorporé le plasmide pSVS dhfr résistent à ce traitement et peuvent traduire le gène d'intérêt S.

Autres vaccins anti-hépatite B

Engerix B® et HBvax DNA® (ou Recombivax®) sont fabriqués sur le même principe mais avec quelques différences : absence de la séquence pré-S2 dans le plasmide recombinant, utilisation de levures à la place des cellules CHO (ce qui a deux conséquences liées à l'activité fonctionnelle particulière des levures : non glycosylation des protéines HBs obtenues, nécessité d'un broyage en raison de l'absence d'exocytose des produits élaborés).

LES RISQUES

Les risques sont liés à la fois aux milieux de culture et aux techniques du génie génétique et concernent essentiellement dans les deux cas la contamination du produit final par de l'ADN.
Cet ADN est potentiellement cancérigène :
- d'une part parce qu'il peut contenir des résidus aux conséquences cancérigènes (il faut rappeler que les cellules de lignée continue type CHO ont des caractères de cellules cancéreuses : caryotype anormal, perte de l'inhibition de contact),
- d'autre part, et surtout, parce que de l'ADN peut, en s'intégrant dans le génome de nos cellules, réactiver un proto-oncogène ou inactiver un anti-oncogène. Ce risque est d'autant plus inquiétant que dans les impuretés d'ADN peuvent se retrouver les séquences virales utilisées pour la confection du plasmide recombinant, notamment les promoteurs.
Un groupe d'experts réunis par l'OMS en 1986 avait évoqué le risque de " malignité que pourrait présenter à long terme un ADN contaminant hétérogène, en particulier s'il s'avère qu'il contient des séquences codantes ou régulatrices potentiellement oncogènes. " En raison de ces risques, l'OMS a fixé la dose limite admissible à 100 pg d'ADN par dose purifiée, limite relevée en 1998 à 10 ng. Les vaccins contre l'hépatite B en contiennent entre 1 et 30 pg par dose. Est-ce à dire qu'une quantité aussi infime que un picogramme soit sans danger ? Certainement pas quand on sait que cela représente un milliard de paires de bases d'ADN et que la dimension d'un promoteur viral n'excède pas 20 à 40 paires de bases. confused

Les experts, auteurs du rapport technique 747 (1987) déclaraient d'ailleurs très prudemment : " Il faut tenir compte de plusieurs points lorsqu'on fait ces estimations du risque :
Premièrement, tous les calculs sont fondés sur le postulat selon lequel le facteur de risque d'induction tumorale décroît linéairement avec la concentration d'ADN. Ce postulat n'est pas forcément exact, puisqu'une quantité d'ADN qui n'a aucun effet biologique mesurable lors d'un essai normalisé parce qu'elle est présente à une trop faible concentration, peut quand même avoir un effet dans certaines conditions ou sur certains organes ou tissus.
Deuxièmement, on ignore encore si le risque associé à des expositions répétées à de l'ADN agira de façon cumulative ou non. confused

Troisièmement, il faut envisager la possibilité que les préparations d'ADN qui n'induisent pas de tumeurs dans les systèmes expérimentaux puissent provoquer chez l'homme des modifications susceptibles d'accroître l'incidence de l'apparition de tumeurs après de longues périodes de latence. confused

Quatrièmement, les expériences conduites sur des animaux à courte durée de vie ne permettent pas d'évaluer les effets à long terme des séquences d'ADN acquises. " confused

Contaminations protéiques
Les opérations de construction des plasmides recombinants nécessitent l'emploi de diverses enzymes parmi lesquelles la déoxynucléotidyl terminale transférase (dTT) capable d'ajouter des nucléotides à l'ADN sans la présence de matrice et de provoquer ainsi des mutations. Les vaccins Engerix B® en ont contenu. En contiennent-ils encore ?? Les vaccins antihépatites sont plus ou moins chargés en impuretés (entre 1 et 5%), probablement protéiques pour l'essentiel, sans qu'on sache de quoi il s'agit. Enzymes ? Protéines transformantes ? Toutes ces molécules sont-elles désactivées ?

Inconvénients de la co-amplification
Après transfection, un phénomène de co-amplification se produit, entre les gènes S et dhfr, stimulé par des traitements à dose croissante de méthotrexate. Malheureusement, ces systèmes d'amplification présentent un inconvénient majeur, celui d'entraîner des remaniements génétiques (translocations, délétions). Certains de ces événements peuvent se produire dans la séquence d'ADN codant pour la protéine souhaitée et conduire à la production d'une protéine altérée, potentiellement dangereuse lors d'un usage thérapeutique. Y aurait-il là un début d'explication aux nombreux troubles observés chez les sujets vaccinés contre l'hépatite B ? Les troubles observés après vaccination contre l hépatite B, sont tout à fait comparables aux complications de l hépatite B elle-même. Les accidents sont très divers et peuvent toucher la plupart des organes :
- au premier rang, les accidents neurologiques : sclérose en plaques, leucoencéphalite, myélite transverse, ataxie cérébelleuse aiguë, polyneuropathie, - accidents oculaires, notamment les occlusions de la veine centrale de la rétine, - accidents musculaires : myofasciite à macrophages (douleurs musculaires et articulaires, fatigue intense),
- accidents osseux et articulaires,
- accidents dermatologiques : lichen plan, érythèmes divers, alopécie,
- accidents rénaux : glomérulonéphrites,
- accidents cardiovasculaires : vascularites, périartérites noueuses,
- accidents sanguins : purpura thrombopénique,
- maladies auto-immunes : lupus érythémateux disséminé, diabète insulinodépendant.

Deux causes peuvent être à l'origine de ces accidents :
- La première est d'ordre immunologique.Le virus de l'hépatite B n'est pas cytopathogène, la destruction des hépatocytes proviendrait de la réaction immunitaire et les complications de la maladie résulteraient de dépôts de complexes immuns déclenchant une réaction inflammatoire et une destruction des tissus, là où s'est produit le dépôt. Les complexes de grande taille sont normalement détruits par les macrophages mais, si l'affinité entre antigène et anticorps est faible, les complexes immuns sont de petite taille, solubles, et finissent par se déposer sans avoir été détruits
[size=18] Un cas particulier est celui de la myofasciite à macrophages, due à une accumulation, dans le tissu conjonctif du muscle ayant reçu l'injection, de macrophages contenant des cristaux d'aluminium (utilisé comme adjuvant du vaccin). Il s'ensuit une activation permanente du système immunitaire- [color:507c=darkblue:507c]La seconde cause serait le mimétisme moléculaire entre des éléments du virus (ou du vaccin) et des molécules de l'organisme, par exemple dans les atteintes démyélinisantes. De plus, l'interféron gamma, produit au cours de la réaction immunitaire, provoque l'expression de molécules HLA II par des cellules qui ne les expriment pas habituellement. Ces cellules deviennent alors capables de présenter au système immunitaire des peptides inhabituels qui ne sont plus reconnus comme faisant partie du soi, d'où leur destruction. Un mécanisme de ce type est probablement à l'origine du diabète insulinodépendant. Divers haplotypes HLA prédisposent aux maladies auto-immunes : A1,B8,DR3 pour l'auto-immunité en général, A3,B7,DR2 pour la sclérose en plaques, B8 et/ou DR3 pour une déficience de la fonction éliminatrice des complexes immuns par les macrophages. Ces troubles sont régulièrement publiés, surtout depuis l'obligation de vaccination du personnel médical (1991) et les grandes campagnes de vaccination de 1994-95, tant dans les revues internationales (parmi lesquelles The Lancet, New England Journal of Medicine, British Medical Journal, Science, Neurology, Journal of Hepatology, American Journal of Ophtalmology, Journal of Rheumatology, Clinical Nephrology, Nephron, American Journal of Epidemiology, Muscle and Nerve), que françaises (La Presse Médicale, Archives de Pédiatrie, Revue de Médecine interne). L'évaluation quantitative précise de ces accidents est difficile car la pharmacovigilance n'en recense qu'une faible partie (entre 1 et 10%). A titre d'exemple, dans le suivi qui se voulait "intensif" de la campagne scolaire de vaccination, 99% des lycéens inclus dans le programme de surveillance ont été perdus de vue, seuls 100 sur 10 000 ayant été suivis à trois ans. Officiellement, d'après son rapport du 21 mai 2002, l'AFSSAPS a recensé 1149 affections démyélinisantes (dont 802 scléroses en plaques et 36 scléroses latérales amyotrophiques), 43 thrombopénies auto-immunes et 14 aplasies médullaires. Le REVAHB (association de victimes) a par ailleurs recensé 24 décès, 319 pathologies auto-imunes (dont 103 polyarthrites, 44 lupus, 41 diabètes type 1, 39 spondylarthrites). E3M (association de victimes de la myofasciite à macrophages) a recensé 160 cas de myofasciite et il en est diagnostiqué actuellement environ 6 par semaine.
Les techniques de l'ADN recombinant permettent de fabriquer de nombreuses molécules à usage thérapeutique. S'il est concevable, malgré les risques, de les utiliser pour traiter des malades surtout lorsque le pronostic vital est en jeu, est-ce aussi admissible pour des vaccins, injectés à des sujets en bonne santé qui ne contracteraient peut-être jamais la maladie dont on veut les protéger. Il y a dans ce domaine un déficit d'information majeur qui ne permet pas au citoyen d'effectuer un libre choix éclairé et responsable.
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ADN ET HLA Question

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Michel GEORGET
Professeur honoraire des Classes préparatoires aux Grandes Ecoles Biologiques

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